Repairing critical-size segmental defects: morphology of tissue engineering bone scaffolds and its effects on cell loading

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.022

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Tissue engineering bone application for repairing critical-size segmental defects is still in research stage. The ideal construction methods have not yet been found.

OBJECTIVE: To review the research literatures on tissue engineering bone scaffold material, its shape and effect on the loading of seeding cells, seek appropriate engineered bone scaffolds which are capable of loading a large number of cells effectively and probably, and provide a new way of repairing segmental bone defects.

METHODS: The first author performed a data retrieval of PubMed and Wanfang databases from 1994 to 2013, to search the articles addressing the construction method of tissue engineering bone scaffold, and reviewed the literatures systematically.

RESULTS AND CONCLUSION: A total of 379 references were retrieved, including 161 articles in Chinese and 218 articles in English. According to the inclusion and exclusion criteria, 53 articles were finally involved in the analysis. The analysis results indicated that, the needed volume of bone tissue engineering scaffolds for critical-sized section bone defect reconstruction is big, which needs to load a huge number of seed cells. If there is no suitable forms and shapes for cell adhesion, the property of so-called engineered bone is similar to pure artificial bone implants. The effective load of seed cells on engineering bone scaffold material and keeping the activity is the first step in clinical practice, as well as the important guarantee for loading bioactive seed cells. Hence, a more simple and accurate detection method for loading cell quantity is needed. Looking into the retrieved content, effective load cell quantity and its bioactivity are detected by indirect methods, supporting the effectiveness of cell seeding. Some methods can guarantee the cell quantity and seeding pattern, the real load is unknown as well as the activity. Fabricating engineering bone scaffold into special form and shape are easy to effective seeding, proliferation and maintaining the biomechanical performance, inducing osteogenesis, and finally detecting the load cell quantity and activity on the scaffold through the simple and direct method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: tissue engineering, biomechanics, stents, organism forms

CLC Number:

R318

Zeng Xian-li, Yang Chun-lu. Repairing critical-size segmental defects: morphology of tissue engineering bone scaffolds and its effects on cell loading

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4717-4723.

Figures/Tables 1

2.1 纳入资料基本概况纳入的文献包括证实接种于大段骨缺损骨支架材料上的种子细胞有效程度的文章10 篇[1-10]，探讨种子细胞体外接种于工程骨支架不同模式下结果的文章5篇[11-15]，探讨适宜有活性种子细胞负载的支架材料构建及制作方法的文章35篇[16-50]，说明细胞接种表现的文章3篇[51-53]。以此为依据对用于修复临界节段性骨缺损工程骨支架形态、形状对细胞接种有效性的影响进行了归纳和总结。 2.2 纳入资料的研究结果特征 2.2.1 接种于骨支架材料上的种子细胞有效程度的证实临界节段性骨缺损的重建一直是临床面临的挑战，需要多次手术来恢复受损区的结构与功能，为了克服这一缺陷，使用生物可降解的骨组织工程支架将提供适宜的治疗途径。骨组织工程是构建具有生物活性的修复骨缺损的植入物，而保持这种生物活性的主要成分是种子细胞，其能够达到的有效数量将是发挥预想成骨的关键所在。如果支架材料所负载的细胞数量很少，达不到发挥正常生理作用，所植入材料无疑类似单纯人工骨的作用。能够使种子细胞有效负载于工程骨支架材料上并保持活性是用于临床治疗的第一步，所负载有生物活性种子细胞数量的多少将是成功与否的重要保障。由此，这就要求负载种子细胞数量的检测手段更要简便、准确和科学。目前针对接种种子细胞有效程度或种子细胞数量和活性的检测多是通过间接方法来佐证。李涛等[2]将成骨诱导细胞与血管内皮细胞按比例接种于5 mm×5 mm× 3 mm珊瑚羟基磷灰石上，通过检测实验组与对照组碱性磷酸酶、骨钙素含量以及新生骨的成熟程度来说明种子细胞负载于支架的有效程度。朱肖奇等[3]将成骨诱导的骨髓间充质干细胞接种于经骨脱钙处理后的20 mm×5 mm× 5 mm大小同种异体骨块上，然后植入动物骨缺损处，通过Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶含量及新骨形成等情况阐述处理结果。贾祎佳等[4]使用微量移液器均匀接种种子细胞于 10 mm×3 mm×3 mm生物活性玻璃支架上，后植入动物骨缺损处，通过成骨情况的评价说明种子细胞与支架的相互作用。程晓兵等[5]将来源于实验动物四肢长骨的骨髓基质细胞接种于多孔β-磷酸三钙圆盘状支架(直径15 mm，厚约1.5 mm)材料上。通过扫描电镜观察材料上细胞生长情况，通过紫外线490 nm波长吸光值及碱性磷酸酶检测观察细胞增殖情况及活性。隋杰等[6]将人脐带间充质干细胞滴加于10 mm×5 mm多孔聚乳酸支架上，植入动物肌肉内，通过检测观察成骨情况，推断接种的有效程度。王明海等[7]将种子细胞接种于用可注射纳米相羟基磷灰石胶原复合材料制成片层状白色固体材料上，共同培养。通过MTT法及碱性磷酸酶活性检测观察细胞增殖及活性。徐卫袁等[8]将骨髓间充质干细胞悬液按一定密度接种于由多孔丝素蛋白修剪成的载牛骨形态发生蛋白的 20 mm×10 mm×5 mm长方体支架上，植于L5-6棘突间，通过影像学、组织学检测到的成骨情况说明工程骨的有效程度。上述实验基本上都是通过扫描电镜、影像学、组织学以及骨钙素和碱性磷酸酶的检查等方法所得到的结果间接说明种子细胞负载于支架上的有效程度，方法并不直接，没有证实接种于支架材料上的种子细胞具体数量，而且没有说明采用何种办法能使接种的细胞有效地留在支架上而不流失。有些培养种子细胞和接种的模式可以保障接种的细胞数量。张蓉等[9]取四肢长骨干骺端剪碎冲洗之细胞为种子细胞，经传代培养直至培养皿底形成半透明乳白色薄膜样物。用此膜包裹长30 mm、外径5 mm、内径2 mm的管状珊瑚支架体外构建工程骨。通过染色可见细胞能够移行至材料表面并保持活性。文中没有对种子细胞为何种细胞进行定性，最终有多少细胞处于具有生物活性状态并不知晓，而且此种种子细胞的提取方式在实际应用中受到极大的限制。姚超等[10]将骨髓基质干细胞成骨诱导后培养成膜片复合到聚乳酸3 cm×1 cm×1 cm长方体支架表面，植入骨缺损处，通过组织学检测观察成骨情况。但接种细胞具体数量未知，其活性未检测。 2.2.2 种子细胞体外接种于工程骨支架不同模式下结果的探讨如何使种子细胞高效接种于支架材料并实现快速增殖是组织工程骨体外研究的关键环节。目前常用的接种方式是静态接种培养、持续负压吸引、旋转式培养、灌注培养等。其中静态培养方法应用历史最久，应用范围最广，简单、经济，对培养环境及设备要求较低，适于绝大多数细胞的体外培养，尤其是对大尺寸工程骨支架。但静态培养、持续负压培养系统存在着营养物质分布不均匀、培养细胞数量有限等缺点，旋转式培养不适于较大的支架材料，灌注培养虽然避免了上述不利之处，但就接种于支架上的有效细胞数量仍在探索中。李洪鹏等[11]认为由于重力及营养供应的因素，对细胞支架复合物进行静止性三维培养的过程中，发现细胞多聚集到支架材料的底部和表面，材料内部黏附的细胞数量很少。生理状态下骨骼组织在应力负荷作用下产生形变，推动组织间隙液在骨陷窝及骨小管这个网络系统内流动。这种间隙液的流动对于骨骼组织营养物质的转运及代谢产物的排出具有重要意义。这种间隙液的流动也产生了对骨骼细胞的流体剪切力，此剪切力是骨骼细胞感受的主要应力刺激，对于刺激骨骼细胞增殖、分化及维持正常生理功能具有重要作用。由此，动力性培养相对于静态培养在维持骨组织工程中种子细胞正常功能的发挥方面具有理论优势。通过实验发现在早期(第8天)灌流培养促进了支架材料内细胞的增殖，而第16天，实验组和对照组的细胞数无显著差别，但其钙盐的沉积却大大增加。认为大量基质的沉积将支架的孔隙填塞后影响了营养物质的传输，从而影响了细胞的增殖。另外，动力性三维培养可以促进种子细胞在支架材料中的均匀分布。王林等[12]利用自行研发的光固化快速成型间接制造方法设计并制备可控管道结构支架。为端面直径14.5 mm，长11.2，内部管道直径300-500 μm圆柱状支架，将其夹固在旋转式生物反应器培养容器内，旋转培养，与静态接种组对照。通过MTT法检测两组细胞增殖情况，结果显示实验组优于对照组。但该吸光度值可反映支架材料对负载细胞的毒性，并不能直接说明两组所负载细胞数量上的差异。Schliephake 等[13]利用碳酸钙矿化胶原支架接种人松质骨细胞，静态和动态培养14 d，植入裸鼠臀肌中6周，通过组织学检测和骨钙素、血管内皮生长因子表达检测证实成骨量明显高于对照组，但静态和动态培养两组之间无差异，均无成骨迹象。骨钙蛋白表达上有差异，血管内皮细胞生长因子表达无差异。Gardel等[14]认为组织工程与再生医学对于新骨再生的策略包括自体和异体间充质干细胞与三维支架材料的复合，在体外合适培养环境下制成组织替代物。这种方法对于目前所使用的自体或异体骨移植面临的限制和风险十分重要。然而，在三维支架上培养的骨原细胞面临很多瓶颈问题，比如，营养和氧的有效转运和代谢物的排除。灌注生物发生器能够提供动力环境，对营养成分的供给和废物的排除大有帮助。然而，决定是否作为组织替代物取决于生物相容性、稳定性和安全性，需要得到体内、体外实验证实。体外实验结果不能推断体内情况，因此在应用于临床前往往需要进行动物实验。Cheng等[15]通过对比在壳聚糖/β磷酸三钙支架材料上采用双面、单面和符合Ⅰ型胶原单面三种接种兔骨髓间充质干细胞的方法，发现双面接种方法提高了种子细胞体外的数量和分布，增加体内骨形成的质量和速度。目前，对于采用何种接种方式其有效程度不一，只有找到最适宜的方法才能最终解决组织工程骨生物活力问题。 2.2.3 有活性种子细胞负载的支架材料构建及制作方法组织工程骨支架材料形状、构建模式根据不同需要差别很大，承重部位的材料对于支架材料的强度、载荷能力要求较高。长管状骨(股骨、胫骨)的工程骨材料常被制成圆柱状或圆筒形，从而既能够负载种子细胞，同时又能够具有足够的机械强度；而非承重部位的骨缺损如某些骨肿瘤瘤腔填塞或脊柱手术的后路融合等人工骨材料可制成颗粒状；另外一种人工骨为可注射式材料，通常由2种或多种有机/无机材料混合制成，多应用于浅表性、囊性的骨缺损修复以及椎体成形、骨质疏松等疾病的治疗，可注射式人工骨材料往往也可以与骨形态发生蛋白等生长因子复合，以增强其成骨效应。解决临床上长段或大面积骨缺损一直是临床的一个难题，组织工程骨的研究最有前景和希望的研究方向之一，而理想的组织工程骨需要合适的种子细胞与最佳支架材料的完美结合[16]，为此，诸多研究进行了尝试。多孔支架孔径大小对细胞负载的影响：多孔支架材料用于组织工程骨研究和试验一直得到广泛认可，其孔隙率、通孔率以及孔径大小的适宜程度越来越被重视，并作为主要方向予以验证。虽然组织工程支架的三维多孔结构被认为是有益于促进足够的营养供应，有利于骨生成，但支架的孔隙往往由于骨内生而使养分供应受到限制。设计采用快速成型和凝胶注模方法构建通孔率较高的β-磷酸三钙工程骨支架，通过控制孔隙率构建预想的支架[17]。Jones等[18]通过对所制作的不同大小孔径的工程骨支架材料的研究发现孔径大于100 μm的支架成骨明显。Seitz等[19]报道了定制拥有完全互通管道三维多孔陶瓷支架的骨替物,其部分内部通道尺寸下降至450 μm和厚度下降至 330 μm。Sobral等[20]认为由于能够制作预订形状和孔隙互通结构的工程骨支架材料使得快速成型技术应用极具价值，然而在实际应用中由于其种子细胞接种的低效性和不均匀性使得该技术应用受到很大限制，主要是由于孔隙设计的不合理和低效接种方式。通过制作孔隙大小递减的支架增强细胞效率并控制细胞生存的空间结构，将淀粉与聚已内酯混合，将三维支架设计成孔隙大小呈递减模式，潮湿条件下对支架的力学性能进行动态力学分析和传统的压缩试验，之后进行扫描电镜检查和微CT断层扫描检查。将成骨样细胞接种于支架上，研究细胞接种效能和接种的显域分布。在静态环境下细胞接种的效率比孔径均匀的支架提高一倍余，横断面荧光图像显示细胞分布更加均匀。Roohani-Esfahani等[21]将一种合成材料(锶-锌晶石)制成85%孔隙率、500 μm大小孔隙、有一定抗压强度和压缩模量的陶瓷支架，复合人骨细胞后植入兔桡骨临界缺损处，证实材料能诱导新骨形成。从材料角度说明支架性能，没有说明接种于支架材料上的种子细胞数量。支架材料表明的特殊处理对细胞负载的影响：对基础支架材料表面予以有利于种子细胞复合的涂层，从一定角度对细胞的有效接种、体外增殖和材料降解裨益较大。Nair等[22]使用羟基磷灰石涂层三相陶瓷工程骨支架修复山羊股骨节段性20 mm骨缺损，通过影像学、CT、组织学、组织形态学、扫描电镜和电感耦合等离子光谱等检测证实，复合种子细胞的支架和裸支架组均获得成骨效果，前者成骨量更明显、更成熟。Lickorish等[23]认为骨组织工程策略是基于多孔支架材料作为支持宿主细胞和/或提供的种子细胞内生长。应用表面涂磷酸钙矿物层的大孔聚合物，植入动物股骨缺损处进行体内评价。发现该涂层能减少纤维组织的包裹，生物降解性能良好。Smith等[24]模拟皮质骨形状,使用一层很薄的镁AZ31卷成中空的圆柱形支架，表面涂有不同数量的钙-磷，接种骨髓间充质干细胞后植入兔尺骨临界骨缺陷,证实部分成骨。自体和异体骨作为工程骨支架如能有效接种种子细胞也能获得较好的成骨效果。Li等[25]通过使用固态自由形状的构建技术，按照所需的大小和形状制作聚已酸内酯(PCL)笼支架，内装满取自自体成骨碎片粒子，植入兔板层骨缺损处，与髂骨移植对照。血清骨钙素和胶原蛋白Ⅰ型交联c端端肽(CTx)测定表明有活跃的骨重塑发生。植入10周后的生物力学测试表明髂骨和混合支架组可以恢复正常水平的机械性能。虽然可以避免髂骨移植手术，但所植入的成骨碎片能否有效的获得也是一个必须面临的问题。Xie等[26]将冷藏人骨块通过理化方法脱钙、去蛋白，接种自体骨髓间充质干细胞桥接一侧25 mm猕猴桡骨缺损，空白人骨作为对照植入另一侧。植入后不同时间点检测成骨标记物、影像学、组织学情况以及免疫排斥情况，证实两组成骨良好，但工程骨组愈合时间短，成骨量多。工程骨的血管化对细胞负载的影响: 组织工程骨的血管化有利于接种的种子细胞的营养供给，对成骨起到重要的作用。Viateau等[27]将自体间充质干细胞接种于珊瑚颗粒植入绵羊长骨临界骨缺损，用预制血管膜包裹，对照组植入自体骨。术后6个月，通过影响指标和组织学指标检测，两组成骨情况无差异。Bae等[28]选择三维聚乙内酯支架，内部相通蜂窝多孔结构，提供血管内生管道和成骨引导通路，利用三相骨形态发生蛋白连续释放，获得很好的血管再生和成骨。新方法构建的骨支架对细胞负载的探讨：3D打印技术和纳米材料应用于工程骨研究是一项较新的研究方向，实验效果是可喜的。Warnke等[29]认为羟基磷灰石(HAP)和磷酸三钙(TCP)是两个非常常见的陶瓷材料的骨替代品。然而，两种支架材料很难制成适合骨缺损大小的准确尺寸。一般制成块状或柱状，不能为个人定制完美匹配的支架。使用计算机辅助3D打印技术(一种新兴的快速成型技术)将原材料羟基磷灰石和磷酸三钙粉一层一层地打印而后一起烧结。如此制作的支架具有精确的尺寸和内部孔隙大小等特征。可以根据个体病人数据并通过计算机辅助设计(CAD)技术制作支架的外形和内部结构。将人成骨细胞作为种子细胞接种于3D打印支架上通过扫描电子显微镜和染色后荧光显微镜对细胞的生物相容性进行评估，通过检测荧光蛋白二醋酸盐、碘化丙啶和MTT对细胞活力进行评估，证实羟基磷灰石支架上的细胞比磷酸三钙支架多，羟基磷灰石支架上的细胞活性优于磷酸三钙支架。进一步提出在3D打印的支架内部整合管道以有利于血管和神经生长。Howk等[30]提出优化蛋白质和生长因子的载体，支持骨正常负载，使新骨再生。完善现有的固体自由形态支架设计，增加支架的孔隙率，维持原型设计的力度。使用计算机辅助设计软件设计，然后通过有限元分析获得理论上极限抗压强度。每个支架设计由喷墨打印快速原型制造机器将聚(丙烯酰胺)/磷酸三钙(PPF/TCP)浇铸在石蜡模具上，测试单轴压缩负荷，进行理论和实验值的极限抗压强度和强度系数的比较。结果显示部分支架增加了46%孔隙率和27%极限抗压强度。Ferreira等[31]认为自体骨移植仍然是修复复杂较大骨缺损首选。然而，移植数量的限制和供区并发症使得临床亟需骨替代物。复合骨诱导材料和三维细胞增殖的组织工程骨被推到前台。通过复合骨诱导材料二氧化钛和羟基磷灰石-明胶纳米成分大孔细胞生长支架修复颅面骨缺损，证实其成骨的潜能。Buschmann等[32]认为由于可控的物理和生物特性使得纳米材料越来越多地被制作成组织工程骨用于修复临界尺寸的骨缺损。通过基于聚乳乙醇酸和磷酸钙纳米颗粒的复合支架接种人脂肪干细胞体内体外实验证实了成骨诱导和血管化的特点。构建特殊形态、形状骨支架对细胞负载的影响：通过各种技术将工程骨支架制成特殊形状、形态便于种子细胞的有效接种、增殖，保持一定的生物力学性能，诱导成骨的发生，一直是联合研究的重要目的。虽然目前还没有得到令人满意的突破性进展，但必将为解决临床难题获得可靠的依据。Harley等[33]描述了一种液相合成方法，制作多孔、分层的支架，一面模仿关节软骨的成分和结构，另一面摹仿软骨下骨。这种渐进性的分层设计可以插入到软骨下骨骨软骨缺损的地方，不需要缝合，黏合或固定，具有相通的多孔结构覆盖整个骨软骨缺损区。此外，骨和软骨成分的细微差异能使这些分层的支架具有压缩变形能力，能模拟正常关节的功能。Rumpler等[34]认为组织的形成取决于无数的细胞之间的生化信号；此外，物理参数也表现出对单细胞水平的显著影响。目前，还没有定量解释几何形状如何影响组织生长，这对于骨折愈合和组织工程的意义重大。研究表明，人工三维支架的凹槽几何特性明显影响组织成骨的增长速度。Razi等[35]结合激光烧结技术制作网格状钛移植物预期成为治疗临界尺寸骨缺损替代物，支架具有高度相通的大孔隙和可调机械性能的特点，通过有限元分析网状结构组合证实该结构具有很强的载负能力，孔隙的增多并不影响植入物内部张力。Guda等[36]将模拟皮质和松质骨双层羟基磷灰石支架材料植入修复兔桡骨缺损，通过微CT评估发现总的骨和支架体积比缺损组明显增大，但比自体骨移植组不足。其和自体骨移植组的抗弯韧性、矿物资的绝对密度以及钙磷比明显大于缺损组。Vaquette等[37]采用热致相分离结合静电纺丝技术制作三维多层复合支架，所构建支架由电纺膜构成，而且厚度不限。对静态和动态情况下的机械特性进行评估，多层复合支架仅有部分单独通过热致相分离技术构建的聚已内酯支架的压缩性能，但拉力试验证实其远胜于单独构建，突出了静电纺丝的作用。Papenburg等[38]提出制作磊叠多层多孔微通道板片三维支架，多层板片内孔有助于营养和信号物资的弥散。此外，每层所接种的细胞分布均匀，每层的数据的检查也很容易。在聚乳酸板片上接种小鼠成肌细胞前细胞培养，动态环境下体外培养每层细胞增值情况比静态环境下有优势。合适的支架材料能够为种子细胞提供一个利于附着、增殖并发挥生物学功能的载体[39-50]，同时又能够为某些特定区域的骨缺损修复提供良好的力学支撑，为骨组织修复和重建奠定基础。"

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